CULTIVO IN VITRO DE
CÉLULAS
INTRODUCCIÓN
En
1967 Singh presento una línea celular obtenida de Aedes alpopictus (C6/36) que
ha sido útil para el estudio del virus del dengue por su alta sensibilidad al virus. Para mantener el
cultivo in vitro y regular el crecimiento celular es necesario nutrirlo con factores de
crecimiento como por ejemplo el PDFG derivado de plaquetas y de una amplia lista de especies celulares dentro
de los cuales se presentan fibroblastos, hueso, cartílago, músculo, y células del tejido conjuntivo.
La
vía de señalización en células C6/36
activada por PDFG es a través de la vía RAS/MAPK, que consiste
primeramente en la interacción del ligando con los receptores PDGF que a su vez activan una GTPasa denominada
Ras que inicia una cascada de señalización por medio de la fosforilación de
residuos de serina y treonina en distintas proteínas como Raf-1 las cual se
activa e induce la activación de quinasas las MAPK, esta vía culmina con la
fosforilación de ERK que se trasloca al núcleo e induce la transcripción de
genes relacionados con la proliferación celular.
EXPERIMENTO
Previo
al análisis, se sembraron 150 000 células del mosquito Aedes albopictus (clon)
C6/36 en dos tubos de vidrio y se colocaron a crecer por 48 horas, uno de ellos
en medio con (10%) y el otro al 2% de suero bovino fetal, èste posee varios
factores de crecimiento, por ejemplo PDFG (factor de crecimiento derivado de
plaquetas).
Posteriormente se selecciona 2 tubos rotulándolos al 10% y 2%
- Se adicionò 50 Ul de colorante en cada pozo del soporte.
- Se desprendió las células golpeteando la base del tubo sobre la palma de la mano varias veces y en el vortex.
- Al resuspender la preparación de células varias veces con la pipeta pasteur se transfirió toda la preparación de células de cada tubo de vidrio al eppendorf.
- Se revisó que correspondiera con el ròtulo; se mezcló bien la preparación de células en el tubo marcado 2%, al transferir 50 uL a un pozo con colorante del soporte, se extrajeron 10 uL y se logró llevar a la cámara de conteo para ser analizada, teniendo en cuenta tres conteos para evaluar la tasa de replicación expresada en porcentaje (proporción de células después de 48 horas de exposición a factores de crecimiento) y la viabilidad celular (porcentaje de células vivas en una muestra del cultivo).
RESULTADOS
Cultivo
con suero 10%
Cultivo
con suero 2%
Tasa de división y viabilidad
DISCUSIÓN RESULTADOS
En el conteo de
cultivos observamos que al colocar a crecer las células del mosquito Aedes alpopictus (C6/36) en un medio con
suero bovino fetal al 2% con factores de
crecimiento derivado de plaquetas PDFG se encontró una proporción células vivas un poco mayor que de células
muertas, la viabilidad corresponde
aproximadamente a un 55%, la tasa de división después de 48 horas equivale a
444 células. Para una mayor optimización de cultivos para posteriores estudios
es de mayor eficacia el suero de bovino fetal al 10% ya que
encontramos una tasa de crecimiento mayor aproximadamente 872 células
obtenidas en 48 horas y una viabilidad
del 88% consecuente del hallazgo de un
número mucho mayor de células vivas que de células muertas, como
mencionamos anteriormente estas
condiciones son las optimas para prolongar la sobrevivencia y mantenimiento del
cultivo cuyo objetivo principal es la propagación de la línea celular y
producción de células para la experimentación como es el caso de las células
C6 /36 que son de suma importancia para
evaluar la funcionalidad y propagación
del virus del dengue para posteriormente encontrar una solución para la
enfermedad.
